免(mian)疫组化可(ke)以：（1）恶(e)性(xing)(xing)肿瘤的(de)(de)(de)诊断与鉴别诊断；（2）确定转(zhuan)移(yi)性(xing)(xing)恶(e)性(xing)(xing)肿瘤的(de)(de)(de)原发部(bu)位；（3）对某类肿瘤进行进一步(bu)的(de)(de)(de)病(bing)理(li)分型；（4）发现微(wei)小(xiao)转(zhuan)移(yi)灶，有助于临床治疗方案的(de)(de)(de)确定，包(bao)括手术(shu)范围的(de)(de)(de)确定。
即用型(Envision)快速(su)酶免(mian)疫组化二步(bu)法
实(shi)验方法原理 根(gen)据(ju)聚(ju)合酶技术把辣根(gen)过氧化物酶抗(kang)鼠或/和(he)抗(kang)兔IgG分(fen)子(zi)结合在多聚(ju)酶上形(xing)成多聚(ju)物分(fen)子(zi),其与待(dai)检(jian)的抗(kang)原特异性的结合后(hou)，加入底物显(xian)色。
实验材料 石蜡切
试剂(ji)(ji)、试剂(ji)(ji)盒 PBS柠檬酸盐(yan)缓冲液蒸馏水增(zeng)强剂(ji)(ji)酶标(biao)抗鼠 兔聚合物苏木素酒精二(er)甲苯(ben)树胶(jiao)盐(yan)酸二(er)氨基联苯(ben)胺
仪器、耗(hao)材 烘箱微波盒塑料切片架显微镜胶(jiao)头(tou)滴(di)管
实验步骤(zhou)
一、石(shi)蜡切片置于67℃烘(hong)箱中，烘(hong)片2小时(shi)，脱(tuo)蜡至(zhi)水，用pH7.4的PBS冲洗(xi)三(san)次(ci)，每次(ci)3分(fen)钟（3×3’）。
二、取一定量pH=6.0柠檬酸盐(yan)缓(huan)冲液(ye)(ye)，加(jia)入微(wei)波(bo)(bo)盒中，微(wei)波(bo)(bo)加(jia)热至沸腾，将脱蜡水(shui)(shui)化后(hou)的(de)(de)组织切片置于耐(nai)高温塑料切片架上(shang)，放入已沸腾的(de)(de)缓(huan)冲液(ye)(ye)中，中档微(wei)波(bo)(bo)处理10分(fen)钟，取出(chu)微(wei)波(bo)(bo)盒流水(shui)(shui)自(zi)然泠(ling)却，从缓(huan)冲液(ye)(ye)中取出(chu)玻片，先用蒸馏水(shui)(shui)冲洗(xi)两次，之后(hou)用PBS冲洗(xi)2×3’。（注：不是所有的(de)(de)抗体都需要微(wei)波(bo)(bo)修复的(de)(de)，视具体情况而定）
三、每张(zhang)切片加(jia)1滴3%H2O2，室温下(xia)孵育10分钟，以阻断(duan)内源(yuan)性过(guo)氧化(hua)物(wu)酶的活性。PBS冲洗3×3’。
四、除去PBS液，每张切(qie)片(pian)加1滴相应(ying)的第一抗体（相应(ying)稀释倍数(shu)），室温(wen)下孵育2小(xiao)时。
五(wu)、PBS冲洗3×5’。除去PBS液，每张切片加1滴聚合物(wu)增强(qiang)剂，室温下孵(fu)育20分钟。PBS冲洗3×3’。
六、除去PBS液(ye)，每张切片加1滴酶(mei)标(biao)抗(kang)鼠/兔聚合(he)物，室温下(xia)孵育30分钟。PBS冲洗3×5’。
七、除(chu)去PBS液(ye)(ye)，每(mei)张(zhang)切(qie)片加1滴新鲜配制的(de)DAB液(ye)(ye)（二(er)氨基联苯胺），显微镜(jing)下观察5分钟(zhong)。
八、苏木素复染，0.1%HCl分化，自来水冲洗，蓝化，切片经梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固，晾(liang)干后观察。
其他
一、特点
1. 在切片加上(shang)(shang)一抗后，第二抗体标记多聚螯合物(wu)酶（HRP）的(de)复合物(wu)与一抗结合，在多聚螯合物(wu)上(shang)(shang)有大量的(de)HRP分子，使抗原信号有显著的(de)放大，其(qi)敏感性较SABC、SP法高。
2. 由(you)于(yu)多聚物在体内不存在，又不使(shi)用生(sheng)物素，从而避免(mian)了由(you)于(yu)生(sheng)物素引(yin)起的非特异性背(bei)(bei)景染色，背(bei)(bei)景比SABC、SP法清晰(xi)。
3. 辣根过氧化物(wu)酶与二(er)抗(kang)(kang)结合在(zai)多聚物(wu)上，替代传统方法的 二(er)抗(kang)(kang)、三抗(kang)(kang)，减(jian)少(shao)了(le)实(shi)验(yan)(yan)步骤，且试剂孵育时(shi)间(jian)短(duan)(duan)，只需15分钟，使(shi)得免(mian)疫组化方法更简单，实(shi)验(yan)(yan)时(shi)间(jian)比(bi)SABC、SP法大(da)为缩(suo)短(duan)(duan)。
链霉菌(jun)抗生物素蛋白-过氧化物酶连结SP法
实验方法原理(li)
SP（streptavidin-perosidase）法，即链霉菌抗生物(wu)素蛋(dan)白(bai)-过氧化物(wu)酶(mei)连结法。SP法是最常使用的方法。
试剂(ji)(ji)、试剂(ji)(ji)盒 二甲苯酒精PBS双氧水枸橼酸缓冲液(ye)(ye)羊血清(qing)工作液(ye)(ye)辣根过氧化物酶链霉素卵白素苏木素DAB
仪器、耗(hao)材(cai) 冰箱显微镜烧(shao)杯玻璃缸
实验步(bu)骤(zhou)
一、烤片
68℃，20 min。
二(er)、常规二(er)甲苯脱(tuo)蜡，梯(ti)度(du)酒精脱(tuo)水
二(er)甲苯(ben)I 20 min⇒二(er)甲苯(ben)II 20 min⇒00%酒(jiu)精10 min⇒100%酒(jiu)精10 min⇒95%酒(jiu)精5 min⇒80%酒(jiu)精5 min⇒70%酒(jiu)精5 min
三、阻(zu)断(duan)灭(mie)活(huo)内源(yuan)性过氧化物酶
3%H2O2 37℃孵育10 min，PBS冲洗3X5 min。
四、抗原修复
置0.01 M枸橼(yuan)酸缓冲液（PH6.0）中用煮沸（95℃，15-20 min），自然冷却20 min以上，再(zai)用冷水冲洗缸子，加(jia)快冷却至室温(wen)，PBS冲洗3X5 min。
五、正常羊(yang)血清(qing)工(gong)作液封闭(bi)，37℃10 min，倾去勿洗。
六(liu)、滴(di)加(jia)一抗4℃冰箱孵育过夜，PBS冲(chong)洗(xi)3X5 min（用PBS缓冲(chong)液代替一抗作阴(yin)性对照）；滴(di)加(jia)生物(wu)素标记二抗，37℃孵育30 min，PBS冲(chong)洗(xi)3X5min。
七(qi)、滴加辣根过氧(yang)化物酶标记的(de)链(lian)霉素(su)卵白素(su)工作液，37℃孵育30 min，PBS冲洗3X5 min。
八、DAB/H2O2反应染色，自来水充分冲洗后，苏木素复染，常规脱水，透明(ming)，干燥，封片。
卵(luan)白素(su)-生物(wu)素(su)-过氧化物(wu)酶复(fu)合物(wu)（ABC）法
实验材(cai)料 蜡块切片
试(shi)剂(ji)(ji)、试(shi)剂(ji)(ji)盒 多聚甲(jia)醛蒸馏水蔗糖过(guo)氧化氢甲(jia)醇PBS酒精KPBS牛血清白蛋白叠氮(dan)纳一抗二抗
仪器、耗(hao)材 冰箱(xiang)显微镜(jing)烧(shao)杯
实验(yan)步骤
一、4%多聚(ju)甲醛常规灌注(zhu)固(gu)定，取材并置20%蔗糖溶液（4℃）中过夜。蜡块制(zhi)作(zuo)。切片，贴片。0.01 M KPBS清洗5 min×3后；
二、加入配好(hao)的0.3%的过氧(yang)化氢甲醇(chun)溶液（甲醇(chun)80 ml+0.01 M KPBS 100 ml+30%过氧(yang)化氢）30 min，以消除内源性过氧(yang)化物酶的影响(xiang)，0.01M PBS清洗5 min×3；
三、加(jia)入配(pei)好的(de)0.3% Triton X100（30% Triton X100+0.01 M KPBS 100 ml）30 min，以增加(jia)细胞的(de)通透性，0.01 M KPBS清洗5 min×3；
四、加入用血清稀释液（牛血清白蛋白1.00 g+0.01 M PBS 100 ml+叠氮纳(na)0.08 g）稀释的一抗，4℃存放24-48 h；吸去抗体，0.01 M KPBS洗(xi)5 min×3；
五、加入0.01 M KPBS稀释的的二抗，室温孵育2 h。0.01 M KPBS洗5 min×3；
六、加(jia)入ABC复合物之类的抗(kang)体，室(shi)温(wen)孵育2 h，0.01 M KPBS洗5 min×3；蒸馏水迅速(su)冲三(san)次；
七(qi)、加入显(xian)色(se)液，进(jin)行免疫组织化学(xue)显(xian)色(se)，时间(jian)一般不超过30 min，可(ke)不时在(zai)显(xian)微镜下(xia)进(jin)行观察，待细胞(bao)着色(se)而背底颜色(se)较淡(dan)时马上吸去显(xian)色(se)液，用(yong)蒸馏水迅速(su)冲三(san)次后加入0.01 M KPBS终止反应；
八、梯度酒精脱水之后(hou)，封(feng)片，拍照。
链霉亲和素(su)—生(sheng)物(wu)素(su)—过氧(yang)化物(wu)酶复合物(wu)（SABC）法(fa)
实(shi)验方法(fa)原理
SABC(Strept Avidin-Biotin Complex)法是一种(zhong)(zhong)显(xian)示组(zu)(zu)织和细(xi)胞中(zhong)(zhong)抗原分布(bu)的简便(bian)而敏感的免疫组(zu)(zu)化染色(se)方(fang)法，是众多免疫组(zu)(zu)织化学(xue)方(fang)法的一种(zhong)(zhong)。SABC法：一抗+ 生(sheng)物(wu)素(su)(su)标(biao)记二抗+ 滴(di)加试剂SABC（链(lian)霉卵白素(su)(su)+ 辣根酶(mei)标(biao)记生(sheng)物(wu)素(su)(su)）+ 辣根酶(mei)底(di)物(wu)显(xian)色(se)。目前常用的亲和素(su)(su)从链(lian)霉菌(streptomyces)培(pei)养物(wu)中(zhong)(zhong)提取，因此称(cheng)为链(lian)霉亲和素(su)(su)—生(sheng)物(wu)素(su)(su)—过氧化物(wu)酶(mei)复合(he)物(wu)技术(streptavidin biotin-peroxidase complex method，SABC法)。
生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)(biotin)为含硫的(de)(de)(de)杂环单羧(suo)酸，分(fen)子(zi)(zi)量小(xiao)，通过其羧(suo)基与(yu)蛋白(bai)(bai)质的(de)(de)(de)氨基结(jie)合(he)，从而(er)可标(biao)记抗体(ti)(ti)和(he)(he)酶(mei)(mei)。亲和(he)(he)素(su)(avidin)又(you)称抗生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)蛋白(bai)(bai)，是一(yi)(yi)种糖蛋白(bai)(bai)，在鸡蛋白(bai)(bai)中被发现，分(fen)子(zi)(zi)量为68 000。生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)与(yu)亲和(he)(he)素(su)有很高的(de)(de)(de)亲和(he)(he)力，1个(ge)亲和(he)(he)素(su)分(fen)子(zi)(zi)上(shang)有4个(ge)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)结(jie)合(he)位点。在ABC法中，不对特异性(xing)(xing)第一(yi)(yi)抗体(ti)(ti)进行标(biao)记，而(er)用生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)标(biao)记第二抗体(ti)(ti)，染色前按一(yi)(yi)定比例将亲和(he)(he)素(su)与(yu)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)标(biao)记的(de)(de)(de)过氧化物(wu)(wu)(wu)酶(mei)(mei)混(hun)合(he)，制成ABC合(he)物(wu)(wu)(wu)，并使亲和(he)(he)素(su)分(fen)子(zi)(zi)上(shang)至少(shao)空出1个(ge)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)结(jie)合(he)位点。染色时，标(biao)本中的(de)(de)(de)抗原先(xian)与(yu)第一(yi)(yi)抗体(ti)(ti)结(jie)合(he)，后(hou)者(zhe)再与(yu)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)标(biao)记的(de)(de)(de)第二抗体(ti)(ti)结(jie)合(he)，然后(hou)加入ABC复合(he)物(wu)(wu)(wu)，结(jie)合(he)到第二抗体(ti)(ti)的(de)(de)(de)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)素(su)上(shang)，最(zui)终形(xing)成的(de)(de)(de)复合(he)物(wu)(wu)(wu)网络(luo)了大(da)量的(de)(de)(de)酶(mei)(mei)分(fen)子(zi)(zi)。因此，敏(min)感性(xing)(xing)更高。
实验步骤
一、洗载玻片
1. 将载玻片(pian)置于重(zhong)铬酸钾和浓H2SO4混合液中，目的是为了是载玻片(pian)上的硅胶等除(chu)去，同时使一(yi)些肉(rou)眼看不见的凹凸不平(ping)的表面(mian)变平(ping)整，便于组织吸(xi)附(fu)。
2. 置于清水(shui)中清洗，除去残(can)余(yu)的重铬酸钾和浓H2SO4（大约冲一个小时左右）。
3. 将载(zai)玻片(pian)浸(jin)泡于(yu)酒精之(zhi)中， 然后放到架子上，置于(yu)37℃温(wen)箱(xiang)中，将多聚赖氨(an)酸涂布于(yu)玻片(pian)的表面(mian)，由于(yu)Lys带正(zheng)电(dian)，而大(da)多数(shu)的组织带负(fu)电(dian)荷，从而产生吸附(fu)作用。
二、包埋组织
1. 在铁模具中(zhong)加入一些液态石(shi)蜡(la)，先稍微冷却，然后(hou)再将待(dai)包埋的组织(zhi)置于(yu)石(shi)蜡(la)之中(zhong)，并排(pai)列整齐。
2. 将塑(su)料(liao)模(mo)具盒盖上，最后加入少许液体石蜡，进行冷冻(dong)，使(shi)石蜡变成固态。
三、切片
1. 将包埋(mai)好(hao)的(de)组织从模具上取下来(lai)，并置于石蜡切(qie)(qie)片(pian)机(ji)(ji)上，切(qie)(qie)片(pian)机(ji)(ji)通过调节(jie)上下左右来(lai)来(lai)使组织和(he)切(qie)(qie)割方向一(yi)致。
2. 调(diao)节(jie)切(qie)片(pian)的厚度(du)，一般为5 um，如果(guo)比(bi)较难切(qie)，则可以适当调(diao)整(zheng)厚度(du)，用毛(mao)笔将切(qie)割的载玻(bo)片(pian)向外拉，并(bing)用小镊子将包含有完整(zheng)组织的载玻(bo)片(pian)置于40 ℃温(wen)水中。
四、捞组织
当组(zu)(zu)织(zhi)(zhi)(zhi)载(zai)(zai)玻(bo)片(pian)(pian)置于40 ℃温(wen)(wen)水中之前，要(yao)先(xian)将(jiang)水浴中的(de)(de)气泡赶走，以(yi)免气泡受(shou)热(re)上(shang)浮而贴到组(zu)(zu)织(zhi)(zhi)(zhi)上(shang)，组(zu)(zu)织(zhi)(zhi)(zhi)受(shou)热(re)展开，最好是组(zu)(zu)织(zhi)(zhi)(zhi)不起皱纹，用载(zai)(zai)玻(bo)片(pian)(pian)捞组(zu)(zu)织(zhi)(zhi)(zhi)时，一(yi)般(ban)取载(zai)(zai)玻(bo)片(pian)(pian)的(de)(de)下1/3或者(zhe)下1/2一(yi)般(ban)每种组(zu)(zu)织(zhi)(zhi)(zhi)捞5-6张，其(qi)中2-3张是备用的(de)(de)，每张载(zai)(zai)玻(bo)片(pian)(pian)上(shang)通常捞两份组(zu)(zu)织(zhi)(zhi)(zhi)，做对照使用，这样形成的(de)(de)误差(cha)就比(bi)较小了，而且捞载(zai)(zai)玻(bo)片(pian)(pian)的(de)(de)时候(hou)最好方(fang)向一(yi)致，以(yi)便观察，再(zai)将(jiang)捞出(chu)来的(de)(de)载(zai)(zai)玻(bo)片(pian)(pian)置于架子上(shang)，放入37 ℃温(wen)(wen)箱中烘(hong)干(gan)。
五、脱蜡
依(yi)次将载玻片放入(ru)二甲(jia)苯(ben)-二甲(jia)苯(ben)-100%酒(jiu)精(jing)-100%酒(jiu)精(jing)-95%酒(jiu)精(jing)-90%酒(jiu)精(jing)-80%酒(jiu)精(jing)-70%酒(jiu)精(jing)，起脱(tuo)蜡作(zuo)用(yong)的(de)主要(yao)是二甲(jia)苯(ben)，依(yi)据的(de)是相似相溶的(de)原(yuan)理。一般在每个试剂中放10 min，天气热(re)可以少放几分(fen)钟，相反，天气较冷的(de)话(hua)就要(yao)适当延长脱(tuo)蜡时间，一般为12-15 min。
六、抗原修复
脱蜡后在清水中(zhong)冲(chong)洗一(yi)段时(shi)间，加(jia)入3%H2O2浸泡(pao)10 min，从而(er)除去内源性的(de)过氧(yang)化氢(qing)酶，然(ran)后倒掉H2O2，在清水中(zhong)洗两次，再(zai)加(jia)入柠檬酸缓冲(chong)液，放(fang)入微波(bo)炉中(zhong)蒸煮(zhu)3 min（中(zhong)火），一(yi)般刚到沸(fei)腾即可，冷(leng)却(que)至室温，然(ran)后再(zai)蒸煮(zhu)一(yi)次，冷(leng)却(que)至室温，蒸煮(zhu)的(de)目(mu)的(de)是为(wei)了使抗原的(de)位点暴露出来。
七、血清封闭
冷却至室温后(hou)，将柠檬酸缓冲液(ye)倒掉，水洗2次，并(bing)将载玻片(pian)置于PBS中(zhong)5 min，洗2次，擦干组(zu)织周围(wei)的PBS液(ye)，马(ma)上加上血清，使一些非(fei)特异性的位点封(feng)(feng)闭起来，然后(hou)放入37 ℃温箱(xiang)中(zhong)半(ban)小(xiao)时(shi)。血清稀释(shi)10倍（900 ul PBS：100 ul血清封(feng)(feng)闭液(ye)）。
八、加一抗
将温箱(xiang)中(zhong)(zhong)的(de)载玻片(pian)取出(chu)，用吸(xi)水纸(zhi)擦干载玻片(pian)反面和正(zheng)面组织周围的(de)血清，加(jia)一(yi)抗，如果做(zuo)对照实(shi)验，就在对照的(de)组织上加(jia)PBS。加(jia)完一(yi)抗后于4℃冰箱(xiang)中(zhong)(zhong)保存过夜。
九、加二抗
将载玻片从冰箱(xiang)中取(qu)出(chu)，放入PBS中洗(xi)3次(ci)，每(mei)次(ci)5min，擦干组(zu)织周围的(de)PBS后加(jia)上(shang)二抗，然后置于37℃温(wen)箱(xiang)中半小时。
十、加SABC
将片子从温箱中(zhong)取出, 放入PBS中(zhong)洗3次，每次5min，擦干(gan)组织周围的(de)PBS后加(jia)上(shang)SABC， 然后置(zhi)于37℃温箱中(zhong)半小时。SABC稀释100倍（990ul PBS：10ul SABC）。
十一、加显色剂
将片子从温箱中取出(chu), 放(fang)入PBS中洗3次(ci)，每次(ci)5min，擦干组织周(zhou)围(wei)的PBS后加上显色剂(ji)(ji)。（显色剂(ji)(ji)的配置：在1ml水中加1滴(di)显色剂(ji)(ji)A，摇(yao)匀，然后加1滴(di)显色剂(ji)(ji)B，摇(yao)匀，再加1滴(di)显色剂(ji)(ji)C，摇(yao)匀） A：DAB B：H2O2 C：磷酸缓冲液
十二、复染
将显色后的(de)片子(zi)用(yong)清水冲洗一(yi)(yi)段时间后，浸泡于苏木精中染色，一(yi)(yi)般动物(wu)组织(zhi)(zhi)为半分钟，植物(wu)组织(zhi)(zhi)3-5min。
十三、脱水
将复(fu)染(ran)后(hou)(hou)的片子置(zhi)于水中冲洗后(hou)(hou)，依(yi)次将载(zai)玻(bo)片放(fang)入70%酒(jiu)(jiu)精(jing)-80%酒(jiu)(jiu)精(jing)-90%酒(jiu)(jiu)精(jing)-95%酒(jiu)(jiu)精(jing)-100%酒(jiu)(jiu)精(jing)-100%酒(jiu)(jiu)精(jing)-二(er)甲(jia)苯(ben)-二(er)甲(jia)苯(ben)。每(mei)个试剂中放(fang)置(zhi)2min，最后(hou)(hou)浸泡(pao)在二(er)甲(jia)苯(ben)中，搬到通风柜中。
十四、封片
用中性树胶滴在组(zu)织旁边，再用盖(gai)玻片(pian)盖(gai)上，要(yao)先放平一(yi)侧(ce)，然后轻轻放下(xia)另一(yi)侧(ce)，以免(mian)产生气泡，封好片(pian)子后置于通(tong)风柜中晾干(gan)。